MCP：蛋白组学鉴定膀胱尿路上皮癌尿细胞学检测的诊断标记物
景杰生物/解读
编者按：膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。以尿路上皮癌最常见。近年来，对浸润性尿路上皮癌的多种组织学变异有许多新的认识；尿路上皮癌病理诊断和鉴别诊断中有价值的免疫标记和分子检测等方面亦有不少新的发现。目前，尿细胞学检查是常规的实验室检查方法，也是最广泛使用的筛查非侵入性病理膀胱尿路上皮癌（BLCA）的诊断方法。但是该方法的准确性较低，不易发现“瘤级”低的肿瘤，准确性不足是一个重大挑战。
近日，来自韩国的科学家在蛋白质领域TOP期刊Molecular & Cellular Proteomics上发表论文，采用蛋白质组学方法分析10例非侵入性病理膀胱尿路上皮癌(BLCA)患者和10例良性尿路上皮病变(BUL)患者的尿液样本，研究发现神经母细胞分化相关蛋白AHNAK是一种新型有潜力的诊断生物标记物，可用于辅助BLCA和BUL液基细胞学检查的辅助性蛋白质组学标记。
以往的研究已经对临床尿液标本进行了深入的蛋白质组学分析，由于尿液样本易于获取，并且能够进行疾病监测，然而尿液中的蛋白质可以来自各种类型的细胞或分泌物，例如血细胞，来自肾小球或泌尿道的上皮细胞，并且可以是良性和恶性细胞的混合，这样极有可能误导检测结果。
相反，细胞学尿液样本几乎仅含有来自泌尿道内层的上皮细胞，是值得期待的研发方向之一。本文研究人员首次采用基于质谱的蛋白质组学来鉴定通过液基方法收集的尿液细胞学样本中的新型生物标记物，研究流程如下图所示。
1. 在液基细胞学中对尿路上皮癌蛋白质组进行全面分析
本文采用非标定量法，对10例良性尿路上皮病变样本和10例膀胱尿路上皮癌的尿液样本进行蛋白质组分析。研究共鉴定到4839个蛋白，其中具有显著差异的蛋白有112个（fold change>2, P-value<0.05）。平均而言，研究人员分别在良性尿路上皮病变样本和膀胱尿路上皮癌样本中鉴定且定量到>1000和2500个蛋白。分层聚类和主成分分析揭示了两组的紧密聚类及其相应的生物学重复，表明两种疾病存在不同的蛋白质表达模式。
图2 定量结果和PCA分析
2. 全面鉴定FFPE样品中的尿路上皮癌蛋白质组
接着，研究人员进行了交叉验证，鉴定了BLCA和BUL的FFPE样品之间的差异蛋白。质谱分析结果显示鉴定到7911个蛋白，可定量7870个。由统计学分析显示蛋白表达多样性源于肿瘤类型之间的真实生物学差异，758个蛋白显著差异表达（fold change>2，p-value<0.05）。主成分分析揭示了尿路上皮癌和非肿瘤病例组内间的紧密聚集，以及它们相应的生物学重复。
图3 BLCA/BUL蛋白火山图
3.TCGA分析
为了验证上述实验结果，研究人员分析了TCGA数据库中19个BUL和408个BLCA患者的mRNA测序结果，为了避免假阳性结果的出现，他们用多种统计学检验方法最终鉴定到4244个差异表达的基因，在BLCA中1564个基因呈上调表达，2680个基因呈下调表达。
4. ROC曲线分析
为了鉴定可作为更准确的细胞学诊断的标记物，研究人员采用跨平台比较和筛选程序，使用来自液基细胞学样本的蛋白组数据和TGCA数据进行分析，共表达分析鉴定到11个LBC和FFPE蛋白组中的共同蛋白，其中AHNAK、EPPK1、MYH14和OLFM4这四个蛋白可以区分开BLCA和BUL。
为了评估这四个蛋白的鉴别能力，研究人员比较了它们的AUC值，发现每个蛋白的峰在TCGA数据库中的427例癌症样本和19对癌症与对照样本这两个独立的组中显示相似的模式。与正常对照样品相比，膀胱尿路上皮癌中AHNAK和OLFM4的mRNA表达水平显著降低。EPPK1和MYH14均匀分布在两组中。
5. 免疫细胞化学染色验证
为最终确认能够用于鉴别BLCA与BUL的标记物，研究人员对25个FFPE样本进行了免疫染色，染色结果表明AHNAK是唯一可以区分BLCA和BUL的蛋白质。通过免疫组化中进一步研究AHNAK在55和60个LBC样品中情况，其结果显示在尿路上皮癌细胞中AHNAK中免疫细胞化学的特征主要在于核染色，而在正常的尿路上皮细胞中该蛋白质主要定位于细胞质亚细胞区。癌细胞中核AHNAK阳性表达率显著高于非肿瘤尿路上皮细胞，而与良性尿路上皮细胞相比，在尿路上皮癌细胞中观察到细胞质AHNAK表达显著降低。研究人员通过分析AUC计算值，确定AHNAK表达的最佳阈值，在此阈值下，可通过细胞质或细胞核染色准确区分BUL和BLCA。
图5 免疫细胞化学染色
本文结合了质谱实验、数据库分析和生化实验，分析了尿路上皮癌的不同类型样本，这些分析显示AHNAK是一种独特的细胞内蛋白质，其免疫组织化学表达在肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的亚细胞定位不同。
总之，该研究确定了一种新的生物标志物AHNAK，适用于LBC诊断鉴别BLCA和BUL。此外，本研究很可能是首次基于深入的蛋白质组学鉴定了LBC的临床生物标志物。
LC-MS/MS技术突破了高通量基因组学应用于人细胞学样品的主要实际限制，表明了蛋白水平变化对疾病的重要影响。同时也表明蛋白质组学研究可以实现大规模水平上研究蛋白质的特征，从而获得蛋白质水平上关于疾病发生等过程的综合性认识。
参考文献：
Lee, H., et al., 2018, Quantitative proteomic analysis identifies AHNAK as a novel candidate biomarker for bladder urothelial carcinoma diagnosis by liquid-based cytology. Molecular & Cellular Proteomics.
以上即为今天的文献解读，景杰生物提供专业、全面的高通量蛋白质(修饰)组学解决方案，详情请咨询当地学术顾问团队或点击景杰生物-在线客服进行沟通咨询！
想了解蛋白质组学与修饰组学更多领域运用，也可后台点击行业精选-关键词检索（如膀胱癌），搜索相关学科热点。
精准医学与蛋白组学
海量文献解读
行业前沿报导
关注/投稿
随时享受科技服务